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壳寡糖抑制肿瘤作用的研究
发布日期:2017-12-19 作者:未知

壳寡糖抑制肿瘤作用的研究﹡

  杜昱光 白雪芳 金宗濂1 燕秋2 朱正美2 (中国科学院大连化学物理研究所,大连 116023)

摘 要:本文通过对几种寡聚糖对Sarcima-180癌细胞的抑制作用试验,筛选出其中有较强抑瘤作用的壳寡糖。并对不同工艺制备的壳寡糖用体外抑瘤方法进行抑瘤活性比较,结果表明:3种壳寡糖中对癌细胞DNA合成的抑制作用效果最好的是C-III-2,抑制率达98.5%。将不同剂量的壳寡糖(C-III-2)经口给予小鼠30天后,与对照组比较,中剂量组(6.7mL/kg.bw)的荷腹水瘤小鼠存活时间延长34%,荷实体瘤小鼠瘤重降低63%;高剂量组(20.0mL/kg.bw)的荷腹水瘤小鼠存活时间延长35%,荷实体瘤小鼠瘤重降低76%;实验结果表明口服中剂量或高剂量壳寡糖C-III-2对肿瘤有抑制作用.壳寡糖C-III-2对多种肿瘤细胞体外的抑制作用试验表明:壳寡糖对肝癌细胞有明显抑制作用,抑制率平均达76%,高于顺铂组及对照组;同时对小鼠肝癌腹水细胞的生长也有一定的影响。

关键词:壳寡糖 抑制 肿瘤

STUDY ON THE ANTI-TUMOUR MARINE DRUGS OF CHITOOLIGOSACCHARIDE

 Du Yuguang, Bai Xuefang, Jin zhonglian, Yan Qiu, Zhu Zhengmei

( Dalian Institute of Chemical and Physics,Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023)

ABSTRACT:Three kinds of oligosaccharide from different sources have been tested and compared for their in vitro inhibitory activities on Sarcima-180 cancer cells. The results indicate that the preparation C-III-2 from chitooligosaccharides show the highest inhibitory activity (98.5%) on DNA synthesis in tumor cells. The tested mice were given orally with different dosages of chitooligosaccharide C-III-2 for 30 days. The medium dosage (6.7ml/kg.bw) and high dosage(20ml/kg.bw) extended mouse life by 34% and 35% and reduced tumor weight by 63% and 76% respectively, compared with control. Other test results show that the chitooligosaccharide also inhibited tumor cells from human liver by 76%.

key word: chitooligosaccharide, anti-tumour

* 国家自然科学基金项目(39980012)、国家科委“九五”攻关项目(96-C03-01-01)、中国科学院“九五”重点项目(KY95-S1-220)、 1 北京联合大学应用文理学院,北京100083; 2 大连医科大学生化教研室,大连116023; 壳寡糖通常是由甲壳素脱乙酰化的产物壳聚糖的降解而获得的2-10个氨基葡萄糖以β-1,4-糖苷键连接而成的低聚糖。壳寡糖具有多种优异的生理功能,它能提高机体的免疫能力和抗癌能力[1],改善肠道微生物的区系分布,刺激有益菌的生长[2],还可作为植物功能调节剂,刺激植物生长[3],增强植物对病虫害的防御能力[4]。因此,对它的研究及开发利用,具有十分重要的意义。根据壳寡糖具有抑制肿瘤生长的生理功能,利用经过酶降解及反应分离耦合等生化工程新技术,采用不同工艺制备的壳寡糖,进行了抑瘤活性筛选、体外及体内抑瘤作用试验,试验方法及结果如下:

1材料与方法:

1.1 材料

1.1.1 甘露寡糖(由中科院微生物所提供)

1.1.2 磺化甘露寡糖(由中科院微生物所提供)

1.1.3 壳寡糖(由中科院大连化物所603组提供)

1.1.4 患S-180腹水癌昆明小鼠(由北京药物所提供)

1.1.5 昆明种1月龄雌性二级小鼠,体重18-22g(中国医学科学院动物中心繁育场提供)1.1.6 肝癌、宫颈癌(Hela)、红白血病(K562)、

淋巴白血病(Raji)四种人肿瘤和小鼠肝癌腹水(Hepa)(由大连医科大学病理教研室提供)1.1.7 小鼠肝癌高淋巴道转移细胞系HCa-F(由

大连医科大学病理教研室提供)

1.2 方法

1.2.1 壳寡糖的制备

        壳寡糖(低聚氨基葡萄糖)是以蟹、虾的外壳甲壳质(几丁质),经脱乙酰化处理后得到壳聚糖为原料,通过酶降解及反应分离耦合等

生化工程技术制备而成。不同的制备工艺得到不同的壳寡糖,即C-III-2,C-II-2,C-I-2。

1.2.2 壳寡糖的测定方法

       通过盐酸水解成游离氨基葡萄糖释出,以水为对照,在535nm处测定光密度值。由标准曲线求出中氨基葡萄糖的含量[5] 。

1.2.3同位素掺入实验方法

       由已接种7-8天患S-180腹水癌昆明小鼠5只,无菌制成混合腹水,染色,镜检,癌细胞≥95%,用Eagle,s液稀释成3.5×106/ml。实验分

成本底、对照和实验等三组,每个样设三个平行管。各管按上述顺序加完后,混匀,37℃保温4小时后,细胞收集器收集癌细胞于玻璃纤维

膜、用冷生理盐水洗涤2次每次5秒钟,间隔空抽2秒。最后用10%TCA洗涤并固定细胞,干燥,置于闪烁杯中,消化,冷却,各管加7ml闪烁

液。LKB-1209全自动液闪仪进行测量(cpm)。按公式抑制率=[对照管(cpm)-实验管(cpm)]/对照管(cpm)×100%计算样品对癌细

胞DNA合成的抑制率。

1.2.4 壳寡糖的筛选方法

        以不同批次的壳寡糖C-III-2(48.3mg/ml),C-II-2(52.3mg/ml),C-I-2(47.6mg/ml)为原液、稀释10倍和稀释100倍三个剂量,除空白

对照外,其余各组均设无瘤细胞组,最后计算抑制率。

1.2.5 动物试验的剂量

       小鼠的等效剂量相当于人体推荐剂量的10倍。分别以人体推荐剂量的5倍、10倍和30倍作为低(3.3ml/日/kg体重)、中(6.7ml/日/kg体

重)、高(20.0ml/日/kg体重)剂量。采取灌胃法,每日灌胃一次,对照组灌蒸馏水。各组小鼠连续给予受试物30天。

1.2.6 移植性肿瘤试验(腹水瘤)的方法

       收集腹腔瘤细胞悬液:H22瘤细胞复苏后接种于小鼠腹腔内,传代一次后7~10天的动物,颈椎脱臼处死。固定于蜡版上,腹部皮肤消毒

后,剪开并剥去腹部皮肤。用消毒空针穿过腹部肌肉,抽取腹水,放入无菌试管内,试管周围置冰块保存。若用多只动物供瘤时,应将腹水

混合,瘤细胞计数结果。接种: 用Hanks工作液稀释瘤细胞悬液至活细胞数为2×106个/mL。在给予受试物15天后将肿瘤细胞接种于空白对

照组、环磷酰胺对照组和低、中、高剂量组小鼠的腹腔内,每只小鼠0.2 mL。继续给予受试物15天。同时环磷酰胺对照组腹腔注射环磷酰胺

1.5mg/天/只。观察各组小鼠的存活时间。本试验需重复一次。接种后次日起逐日记录体重,并观察记录动物死亡情况。

1.2.7 移植性肿瘤试验(实体瘤)的方法 收集腹腔瘤细胞悬液

       H22瘤细胞复苏后接种于小鼠腹腔内,传代一次后7-10天的动物,颈椎脱臼处死。固定于蜡版上,腹部皮肤消毒后,剪开并剥去腹部皮

肤。用消毒空针穿过腹部肌肉,抽取腹水,放入无菌试管内,试管周围置冰块保存。若用多只动物供瘤时,应将腹水混合,瘤细胞计数结

果。接种方法同上。

1.2.8 小鼠碳廓清实验的方法

      对每只小鼠尾静脉注射稀释4倍的印度墨汁,0.1mL/10g体重。待墨汁注入后立即记时。分别于注入墨汁后1、10min取血0.02mL加至

2mL碳酸钠溶液中,600nm波长处测定光密度值,以碳酸钠溶液作对照。另取肝脏和脾脏称重。以吞噬指数来表示巨噬细胞吞噬功能。

1.2.9 抑制肿瘤细胞生长的检测方法采MTT(四唑蓝)法

  实验重复两次,每组实验设平行孔,壳寡糖给药组剂量分别为 1mg/ml,400μg/ml,100μg/ml,10μg/ml,贴壁细胞于实验前一天铺

板,悬浮细胞于实验当天处理。每孔细胞数为1x105,终体积为1ml。阳性对照药物顺铂浓度为10μg /ml。加药后培养72小时,加MTT及溶解

液,于595nm比色测定,并根据吸光度计算抑制率。

1.2.10 排染法检测壳寡糖对HCa-F的抑制率

  分别在第3、6、24小时取各孔的细胞悬液50微升于载玻片上,再加台酚蓝染液50微升,混匀后在显微镜下观察。核蓝染的为死细胞。抑

制率=死细胞数/细胞总数×100%。

2.结果

2.1不同寡聚糖对Sarcima-180癌细胞的抑制作用

  用寡聚糖进行抑瘤试验,筛选抑瘤作用较强的寡聚糖,结果表明:壳寡糖C-III-2的抑瘤率远高于甘露寡糖和磺化甘露寡糖,壳寡糖的三个

处理中,浓度较低的,抑瘤率较高,达到99.5%(见表1)。

                                                               表1. 不同寡聚糖对S-180的抑瘤率

  

样品

用量(mg/mL)

抑瘤率(%)

甘露寡糖

5

59.5

2.5

60.5

1.5

12.9

磺化甘露寡糖

5

18.8

2.5

32.6

1.5

34.8

壳寡糖

9.5

90.5

7.1

98.5

4.7

99.5

 

  2.2壳聚糖不同批次对S-180肿瘤细胞的抑制作用

  用体外抑瘤方法对壳寡糖不同批次进行快速筛选,结果表明:3种不同制备工艺的壳寡糖中对癌细胞DNA合成的抑制作用效果最好的是C-

III-2,三个浓度的抑制率均达到90%以上(见表2)。故随后的抑瘤试验样品均选用壳寡糖(C-III-2)。

                                 

                                               表2 壳聚糖不同批次对S-180肿瘤细胞DNA合成的抑制作用

壳寡糖样品

(批次)

 浓度

(mg/ml)

 抑制率

(%)

平均

(%)

C-III-2

48.3

99.8

98.5

4.83

97.4

0.48

98.2

C-II-2

52.3

87.5

82.8

5.23

81.3

0.52

79.7

C-I-2

47.6

13.3

23.5

4.76

13.5

0.46

43.7

 

  2.3 壳寡糖(C-III-2)抑瘤作用的动物试验

  2.3.1 壳寡糖对腹水瘤小鼠生存时间的影响

   由表3可见,小鼠接种肿瘤后,与对照组比较,环磷酰胺阳性对照组生存时间延长37%(p<0.01);低、中、高剂量组生存时间分别延长

16%(p<0.05),34%(p<0.01),35%(p<0.001)。

 

                                               表3 口服壳寡糖30天对H22腹水瘤小鼠生存时间的影响

组别

剂量

(mL/kg.bw)

动物数 (只)

生存时间(天)

P值

空白对照组

0

12

11.9±2.2

 ——

低剂量组

3.3

12

13.8±2.0*

0.0338

中剂量组

6.7

12

15.9±3.6**

0.0338

高剂量组

20.0

12

16.1±1.5***

1.6×10-5

阳性对照组

0

12

16.3±2.6***

0.0002

注: *p<0.05, **p<0.01,***p<0.001 vs空白对照组

 

2.3.2壳寡糖对实体瘤小鼠瘤重的影响

 

                                           表4 口服壳寡糖(C-III-2)30天对实体瘤小鼠瘤重的影响

组别

剂量

(mL/kg.bw)

动物数 (只)

实体瘤重(g)

P值

空白对照组

0

16

1.640±0.99

 ——

低剂量组

3.3

16

0.618±0.55**

0.0011

中剂量组

6.7

16

0.610±0.64**

0.0015

高剂量组

20.0

16

0.386±0.43***

9.6×10-5

阳性对照组

0

16

1.175±0.64

0.1249

注: **p<0.01,***p<0.001 vs空白对照组

  

        表4可见,小鼠接种肿瘤20天后,与对照组比较,环磷酰胺阳性对照组实体瘤重降低28%(p>0.05),低、中、高剂量组实体瘤重分别

降低62%(p<0.01),63%(p<0.01),76%(p<0.001)。

  综合表3和表4的结果可以看出壳寡糖C-III-2对荷实体瘤小鼠肿瘤具有明显抑制作用。

2.3.3 壳寡糖对正常小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响

 

                                                          表5 壳寡糖对正常小鼠的碳廓清的影响

组别

剂量

(mL/kg.bw)

动物数

(只)

a

P值

空白对照组

0

12

6.55±0.29

——

低剂量组

3.3

12

6.51±0.45

0.7631

中剂量组

6.7

12

6.40±0.69

0.4805

高剂量组

20.0

12

6.56±0.47

0.9884

 

  表5可见,经口给予小鼠不同剂量的受试物30天后,与对照组比较,各剂量组的碳廓清指数均无显著差异(p>0.05)。

  2.3.4壳寡糖对小鼠NK细胞活性的影响

 

                                                        表6 壳寡糖对小鼠NK细胞活性的影响

组别

剂量

(mL/kg.bw)

动物数

(只)

NK活性(1:50)

(%)

空白对照组

0

12

32.8±10.6

低剂量组

3.3

12

29.6±12.7

中剂量组

6.7

12

28.0±12.0

高剂量组

20.0

12

33.4±10.9

 

  表6可见,经口给予小鼠不同剂量的受试物30天后,与对照组比较,各剂量组的NK细胞活性均无显著差异(p>0.05)。

  从表5和表6的结果可知壳寡糖C-III-2对免疫功能影响不明显,同时也表明它不会对小鼠免疫系统造成损伤。

  2.4 壳寡糖对多种肿瘤细胞体外的抑制作用

  壳寡糖对肝癌细胞有明显抑制作用,抑制率平均达76%,高于顺铂组及对照组(见表7)。同时对小鼠肝癌腹水细胞的生长也有一定的影

响(见图1)。

表7 壳寡糖对5种肿瘤细胞的抑制作用

处理                       浓度                                          吸光值(A595nm)                                         抑制率(%)

                             (g/l)                        肝癌  Hela  K562  Raji  Hepa                     肝癌  Hela  K562  Raji  Hepa

                                 1                              0.33  0.49  0.48   0.24  0.33                         73      49       68     70      66

壳寡糖组              400                            0.27  0.51  0.51   0.54  0.48                          76      47      66     33      51

                              100                            0.24  0.65  1.17   0.76   —                             79      32      22       6       —

顺铂组                  0.01                           0.49  0.73  1.31   0.69   —                             56      24      13      15      —

                              0.01                           0.28  0.15  0.65   0.15  0.05                          75      84      57      82     95

对照组                    0                              1.12  0.96  1.50   0.81  0.98

 

 

  下面图1所示壳寡糖对高淋巴道转移癌细胞系Hca-F具有较强的体外杀灭能力,100mg/l壳寡糖的抑瘤能力强于10mg/l顺铂;50mg/l壳寡

糖的抑瘤能力稍弱于10mg/l顺铂;壳寡糖的溶剂乙酸不具有抑瘤作用。

图1 不同时间不同浓度壳寡糖对HCa-F的抑制作用

3.讨论

  国外已有报道,聚合度为4-7的几丁寡糖对BALB/C白鼠的腹膜渗出液细胞具有强烈反应,几丁六糖和壳六糖对Sarcima-180、MM-46、

Meth-A等癌细胞的生长有完全的抑制效果;当Lewis肺癌静脉注入到小白鼠体内,几丁六糖具有抑制癌细胞转移效果。特殊工艺处理,可去除

单糖,二糖等小分子,得到浓缩8-10倍的高活性浓缩液,主要组成为3-8糖,10糖以上的含量极微。其中壳寡糖(C-III-2)经过动物及体外抑制

瘤试验,结果表明效果较好,特别是对肝癌细胞有明显抑制作用,抑制率平均达76%,同时对小鼠肝癌腹水细胞的生长也有一定的影响。

  参考文献

  [1] Mcgahren W.J. et.al.,Chitosan by fermentation,Process Biochem.,1984,19:88

  [2] 张虎,杜昱光,虞星炬,几丁寡糖与壳寡糖的制备和功能,中国生化药物杂志,1999,20(2):99

  [3] 余露,李伟,谭健,低聚糖提高小麦抗病性及其应用于防治小麦赤霉病的研究,生物工程进展,1995,15(6):36

  [4] 杜昱光,白雪芳,虞星炬,韩秀文,寡聚糖类物质生理活性的研究,中国生化药物杂志,1997,18(5):268

        [5]Beeley J G,Glycoprotein and proteoglycan techniques.Amsterdam: Elsevier,1985,Ⅲ.

 

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