壳寡糖抑制肿瘤作用的研究﹡
杜昱光 白雪芳 金宗濂1 燕秋2 朱正美2 （中国科学院大连化学物理研究所，大连 116023）
摘 要：本文通过对几种寡聚糖对Sarcima-180癌细胞的抑制作用试验，筛选出其中有较强抑瘤作用的壳寡糖。并对不同工艺制备的壳寡糖用体外抑瘤方法进行抑瘤活性比较，结果表明：3种壳寡糖中对癌细胞DNA合成的抑制作用效果最好的是C-III-2，抑制率达98.5%。将不同剂量的壳寡糖（C-III-2）经口给予小鼠30天后，与对照组比较，中剂量组（6.7mL/kg.bw）的荷腹水瘤小鼠存活时间延长34%，荷实体瘤小鼠瘤重降低63%；高剂量组（20.0mL/kg.bw）的荷腹水瘤小鼠存活时间延长35%，荷实体瘤小鼠瘤重降低76%；实验结果表明口服中剂量或高剂量壳寡糖C-III-2对肿瘤有抑制作用.壳寡糖C-III-2对多种肿瘤细胞体外的抑制作用试验表明：壳寡糖对肝癌细胞有明显抑制作用，抑制率平均达76%，高于顺铂组及对照组；同时对小鼠肝癌腹水细胞的生长也有一定的影响。
关键词：壳寡糖 抑制 肿瘤
STUDY ON THE ANTI-TUMOUR MARINE DRUGS OF CHITOOLIGOSACCHARIDE
Du Yuguang, Bai Xuefang, Jin zhonglian, Yan Qiu, Zhu Zhengmei
( Dalian Institute of Chemical and Physics,Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023)
ABSTRACT:Three kinds of oligosaccharide from different sources have been tested and compared for their in vitro inhibitory activities on Sarcima-180 cancer cells. The results indicate that the preparation C-III-2 from chitooligosaccharides show the highest inhibitory activity (98.5%) on DNA synthesis in tumor cells. The tested mice were given orally with different dosages of chitooligosaccharide C-III-2 for 30 days. The medium dosage (6.7ml/kg.bw) and high dosage(20ml/kg.bw) extended mouse life by 34% and 35% and reduced tumor weight by 63% and 76% respectively, compared with control. Other test results show that the chitooligosaccharide also inhibited tumor cells from human liver by 76%.
key word: chitooligosaccharide, anti-tumour
* 国家自然科学基金项目（39980012）、国家科委“九五”攻关项目(96-C03-01-01)、中国科学院“九五”重点项目（KY95-S1-220）、 1 北京联合大学应用文理学院，北京100083； 2 大连医科大学生化教研室，大连116023； 壳寡糖通常是由甲壳素脱乙酰化的产物壳聚糖的降解而获得的2-10个氨基葡萄糖以β-1，4-糖苷键连接而成的低聚糖。壳寡糖具有多种优异的生理功能，它能提高机体的免疫能力和抗癌能力[1]，改善肠道微生物的区系分布，刺激有益菌的生长[2]，还可作为植物功能调节剂，刺激植物生长[3]，增强植物对病虫害的防御能力[4]。因此，对它的研究及开发利用，具有十分重要的意义。根据壳寡糖具有抑制肿瘤生长的生理功能，利用经过酶降解及反应分离耦合等生化工程新技术,采用不同工艺制备的壳寡糖，进行了抑瘤活性筛选、体外及体内抑瘤作用试验，试验方法及结果如下：
1材料与方法：
1.1 材料
1.1.1 甘露寡糖(由中科院微生物所提供)
1.1.2 磺化甘露寡糖(由中科院微生物所提供)
1.1.3 壳寡糖（由中科院大连化物所603组提供）
1.1.4 患S-180腹水癌昆明小鼠（由北京药物所提供）
1.1.5 昆明种1月龄雌性二级小鼠，体重18-22g（中国医学科学院动物中心繁育场提供）1.1.6 肝癌、宫颈癌（Hela）、红白血病（K562）、
淋巴白血病（Raji）四种人肿瘤和小鼠肝癌腹水（Hepa）（由大连医科大学病理教研室提供）1.1.7 小鼠肝癌高淋巴道转移细胞系HCa-F（由
大连医科大学病理教研室提供）
1.2 方法
1.2.1 壳寡糖的制备
壳寡糖（低聚氨基葡萄糖）是以蟹、虾的外壳甲壳质（几丁质），经脱乙酰化处理后得到壳聚糖为原料，通过酶降解及反应分离耦合等
生化工程技术制备而成。不同的制备工艺得到不同的壳寡糖,即C-III-2，C-II-2，C-I-2。
1.2.2 壳寡糖的测定方法
通过盐酸水解成游离氨基葡萄糖释出,以水为对照，在535nm处测定光密度值。由标准曲线求出中氨基葡萄糖的含量[5] 。
1.2.3同位素掺入实验方法
由已接种7-8天患S-180腹水癌昆明小鼠5只，无菌制成混合腹水，染色，镜检，癌细胞≥95%，用Eagle，s液稀释成3.5×106/ml。实验分
成本底、对照和实验等三组，每个样设三个平行管。各管按上述顺序加完后，混匀，37℃保温4小时后，细胞收集器收集癌细胞于玻璃纤维
膜、用冷生理盐水洗涤2次每次5秒钟，间隔空抽2秒。最后用10%TCA洗涤并固定细胞，干燥，置于闪烁杯中，消化，冷却，各管加7ml闪烁
液。LKB-1209全自动液闪仪进行测量（cpm）。按公式抑制率=[对照管（cpm）－实验管（cpm）]/对照管（cpm）×100%计算样品对癌细
胞DNA合成的抑制率。
1.2.4 壳寡糖的筛选方法
以不同批次的壳寡糖C-III-2（48.3mg/ml），C-II-2（52.3mg/ml），C-I-2(47.6mg/ml)为原液、稀释10倍和稀释100倍三个剂量，除空白
对照外，其余各组均设无瘤细胞组，最后计算抑制率。
1.2.5 动物试验的剂量
小鼠的等效剂量相当于人体推荐剂量的10倍。分别以人体推荐剂量的5倍、10倍和30倍作为低（3.3ml/日/kg体重）、中（6.7ml/日/kg体
重）、高（20.0ml/日/kg体重）剂量。采取灌胃法，每日灌胃一次，对照组灌蒸馏水。各组小鼠连续给予受试物30天。
1.2.6 移植性肿瘤试验（腹水瘤）的方法
收集腹腔瘤细胞悬液：H22瘤细胞复苏后接种于小鼠腹腔内，传代一次后7～10天的动物，颈椎脱臼处死。固定于蜡版上，腹部皮肤消毒
后，剪开并剥去腹部皮肤。用消毒空针穿过腹部肌肉，抽取腹水，放入无菌试管内，试管周围置冰块保存。若用多只动物供瘤时，应将腹水
混合，瘤细胞计数结果。接种： 用Hanks工作液稀释瘤细胞悬液至活细胞数为2×106个/mL。在给予受试物15天后将肿瘤细胞接种于空白对
照组、环磷酰胺对照组和低、中、高剂量组小鼠的腹腔内，每只小鼠0.2 mL。继续给予受试物15天。同时环磷酰胺对照组腹腔注射环磷酰胺
1.5mg/天/只。观察各组小鼠的存活时间。本试验需重复一次。接种后次日起逐日记录体重，并观察记录动物死亡情况。
1.2.7 移植性肿瘤试验（实体瘤）的方法 收集腹腔瘤细胞悬液
H22瘤细胞复苏后接种于小鼠腹腔内，传代一次后7-10天的动物，颈椎脱臼处死。固定于蜡版上，腹部皮肤消毒后，剪开并剥去腹部皮
肤。用消毒空针穿过腹部肌肉，抽取腹水，放入无菌试管内，试管周围置冰块保存。若用多只动物供瘤时，应将腹水混合，瘤细胞计数结
果。接种方法同上。
1.2.8 小鼠碳廓清实验的方法
对每只小鼠尾静脉注射稀释4倍的印度墨汁，0.1mL/10g体重。待墨汁注入后立即记时。分别于注入墨汁后1、10min取血0.02mL加至
2mL碳酸钠溶液中，600nm波长处测定光密度值，以碳酸钠溶液作对照。另取肝脏和脾脏称重。以吞噬指数来表示巨噬细胞吞噬功能。
1.2.9 抑制肿瘤细胞生长的检测方法采MTT（四唑蓝）法
实验重复两次，每组实验设平行孔，壳寡糖给药组剂量分别为 1mg/ml，400μg/ml，100μg/ml，10μg/ml，贴壁细胞于实验前一天铺
板，悬浮细胞于实验当天处理。每孔细胞数为1x105，终体积为1ml。阳性对照药物顺铂浓度为10μg /ml。加药后培养72小时，加MTT及溶解
液，于595nm比色测定，并根据吸光度计算抑制率。
1.2.10 排染法检测壳寡糖对HCa-F的抑制率
分别在第3、6、24小时取各孔的细胞悬液50微升于载玻片上，再加台酚蓝染液50微升，混匀后在显微镜下观察。核蓝染的为死细胞。抑
制率=死细胞数/细胞总数×100%。
2.结果
2.1不同寡聚糖对Sarcima-180癌细胞的抑制作用
用寡聚糖进行抑瘤试验，筛选抑瘤作用较强的寡聚糖，结果表明:壳寡糖C-III-2的抑瘤率远高于甘露寡糖和磺化甘露寡糖，壳寡糖的三个
处理中，浓度较低的,抑瘤率较高，达到99.5%（见表1）。
表1. 不同寡聚糖对S-180的抑瘤率
|
样品 |
用量（mg/mL） |
抑瘤率（%） |
|
甘露寡糖 |
5 |
59.5 |
|
2.5 |
60.5 |
|
|
1.5 |
12.9 |
|
|
磺化甘露寡糖 |
5 |
18.8 |
|
2.5 |
32.6 |
|
|
1.5 |
34.8 |
|
|
壳寡糖 |
9.5 |
90.5 |
|
7.1 |
98.5 |
|
|
4.7 |
99.5 |
2.2壳聚糖不同批次对S-180肿瘤细胞的抑制作用
用体外抑瘤方法对壳寡糖不同批次进行快速筛选，结果表明：3种不同制备工艺的壳寡糖中对癌细胞DNA合成的抑制作用效果最好的是C-
III-2，三个浓度的抑制率均达到90%以上（见表2）。故随后的抑瘤试验样品均选用壳寡糖（C-III-2）。
表2 壳聚糖不同批次对S-180肿瘤细胞DNA合成的抑制作用
|
壳寡糖样品 （批次） |
浓度 （mg/ml） |
抑制率 （%） |
平均 （%） |
|
C-III-2 |
48.3 |
99.8 |
98.5 |
|
4.83 |
97.4 |
||
|
0.48 |
98.2 |
||
|
C-II-2 |
52.3 |
87.5 |
82.8 |
|
5.23 |
81.3 |
||
|
0.52 |
79.7 |
||
|
C-I-2 |
47.6 |
13.3 |
23.5 |
|
4.76 |
13.5 |
||
|
0.46 |
43.7 |
2.3 壳寡糖（C-III-2）抑瘤作用的动物试验
2.3.1 壳寡糖对腹水瘤小鼠生存时间的影响
由表3可见，小鼠接种肿瘤后，与对照组比较，环磷酰胺阳性对照组生存时间延长37%（p＜0.01)；低、中、高剂量组生存时间分别延长
16%（p＜0.05)，34%（p＜0.01)，35%（p＜0.001)。
表3 口服壳寡糖30天对H22腹水瘤小鼠生存时间的影响
|
组别 |
剂量 （mL/kg.bw） |
动物数 （只） |
生存时间（天） |
P值 |
|
空白对照组 |
0 |
12 |
11.9±2.2 |
—— |
|
低剂量组 |
3.3 |
12 |
13.8±2.0* |
0.0338 |
|
中剂量组 |
6.7 |
12 |
15.9±3.6** |
0.0338 |
|
高剂量组 |
20.0 |
12 |
16.1±1.5*** |
1.6×10-5 |
|
阳性对照组 |
0 |
12 |
16.3±2.6*** |
0.0002 |
注： *p＜0.05， **p＜0.01，***p＜0.001 vs空白对照组
2.3.2壳寡糖对实体瘤小鼠瘤重的影响
表4 口服壳寡糖（C-III-2）30天对实体瘤小鼠瘤重的影响
|
组别 |
剂量 （mL/kg.bw） |
动物数 （只） |
实体瘤重（g） |
P值 |
|
空白对照组 |
0 |
16 |
1.640±0.99 |
—— |
|
低剂量组 |
3.3 |
16 |
0.618±0.55** |
0.0011 |
|
中剂量组 |
6.7 |
16 |
0.610±0.64** |
0.0015 |
|
高剂量组 |
20.0 |
16 |
0.386±0.43*** |
9.6×10-5 |
|
阳性对照组 |
0 |
16 |
1.175±0.64 |
0.1249 |
注： **p＜0.01，***p＜0.001 vs空白对照组
表4可见，小鼠接种肿瘤20天后，与对照组比较，环磷酰胺阳性对照组实体瘤重降低28%（p＞0.05），低、中、高剂量组实体瘤重分别
降低62%（p＜0.01)，63%（p＜0.01)，76%（p＜0.001)。
综合表3和表4的结果可以看出壳寡糖C-III-2对荷实体瘤小鼠肿瘤具有明显抑制作用。
2.3.3 壳寡糖对正常小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响
表5 壳寡糖对正常小鼠的碳廓清的影响
|
组别 |
剂量 （mL/kg.bw） |
动物数 （只） |
a |
P值 |
|
空白对照组 |
0 |
12 |
6.55±0.29 |
—— |
|
低剂量组 |
3.3 |
12 |
6.51±0.45 |
0.7631 |
|
中剂量组 |
6.7 |
12 |
6.40±0.69 |
0.4805 |
|
高剂量组 |
20.0 |
12 |
6.56±0.47 |
0.9884 |
表5可见，经口给予小鼠不同剂量的受试物30天后，与对照组比较，各剂量组的碳廓清指数均无显著差异（p＞0.05)。
2.3.4壳寡糖对小鼠NK细胞活性的影响
表6 壳寡糖对小鼠NK细胞活性的影响
|
组别 |
剂量 （mL/kg.bw） |
动物数 （只） |
NK活性（1:50） (%) |
|
空白对照组 |
0 |
12 |
32.8±10.6 |
|
低剂量组 |
3.3 |
12 |
29.6±12.7 |
|
中剂量组 |
6.7 |
12 |
28.0±12.0 |
|
高剂量组 |
20.0 |
12 |
33.4±10.9 |
表6可见，经口给予小鼠不同剂量的受试物30天后，与对照组比较，各剂量组的NK细胞活性均无显著差异（p＞0.05)。
从表5和表6的结果可知壳寡糖C-III-2对免疫功能影响不明显，同时也表明它不会对小鼠免疫系统造成损伤。
2.4 壳寡糖对多种肿瘤细胞体外的抑制作用
壳寡糖对肝癌细胞有明显抑制作用，抑制率平均达76%，高于顺铂组及对照组（见表7）。同时对小鼠肝癌腹水细胞的生长也有一定的影
响（见图1）。
表7 壳寡糖对5种肿瘤细胞的抑制作用
|
处理 浓度 吸光值（A595nm） 抑制率（%） （g/l） 肝癌 Hela K562 Raji Hepa 肝癌 Hela K562 Raji Hepa |
|
1 0.33 0.49 0.48 0.24 0.33 73 49 68 70 66 壳寡糖组 400 0.27 0.51 0.51 0.54 0.48 76 47 66 33 51 100 0.24 0.65 1.17 0.76 — 79 32 22 6 — 顺铂组 0.01 0.49 0.73 1.31 0.69 — 56 24 13 15 — 0.01 0.28 0.15 0.65 0.15 0.05 75 84 57 82 95 对照组 0 1.12 0.96 1.50 0.81 0.98 |
下面图1所示壳寡糖对高淋巴道转移癌细胞系Hca-F具有较强的体外杀灭能力，100mg/l壳寡糖的抑瘤能力强于10mg/l顺铂；50mg/l壳寡
糖的抑瘤能力稍弱于10mg/l顺铂；壳寡糖的溶剂乙酸不具有抑瘤作用。
图1 不同时间不同浓度壳寡糖对HCa-F的抑制作用
3.讨论
国外已有报道，聚合度为4-7的几丁寡糖对BALB/C白鼠的腹膜渗出液细胞具有强烈反应，几丁六糖和壳六糖对Sarcima-180、MM-46、
Meth-A等癌细胞的生长有完全的抑制效果；当Lewis肺癌静脉注入到小白鼠体内，几丁六糖具有抑制癌细胞转移效果。特殊工艺处理，可去除
单糖,二糖等小分子,得到浓缩8-10倍的高活性浓缩液，主要组成为3-8糖，10糖以上的含量极微。其中壳寡糖（C-III-2）经过动物及体外抑制
瘤试验，结果表明效果较好，特别是对肝癌细胞有明显抑制作用，抑制率平均达76%，同时对小鼠肝癌腹水细胞的生长也有一定的影响。
参考文献
[1] Mcgahren W.J. et.al.，Chitosan by fermentation,Process Biochem.，1984，19：88
[2] 张虎，杜昱光，虞星炬，几丁寡糖与壳寡糖的制备和功能，中国生化药物杂志，1999，20（2）：99
[3] 余露，李伟，谭健，低聚糖提高小麦抗病性及其应用于防治小麦赤霉病的研究，生物工程进展，1995，15（6）：36
[4] 杜昱光，白雪芳，虞星炬，韩秀文,寡聚糖类物质生理活性的研究，中国生化药物杂志，1997，18（5）：268
[5]Beeley J G,Glycoprotein and proteoglycan techniques.Amsterdam: Elsevier,1985,Ⅲ.
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