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壳寡糖的肝脏保护作用
发布日期：2009-07-24 作者：格莱克
壳寡糖对四氯化碳诱导的肝损伤的保护作用
（大连市产品质量监督检验所， 大连民族学院生命科学学院，中国海洋大学生命科学与技术学部）
（大连市产品质量监督检验所， 大连民族学院生命科学学院，中国海洋大学生命科学与技术学部）
摘要： 目的研究壳寡糖（C O S ）对四氯化碳（C C l 4）诱导的肝损伤的保护作用。方法雄性昆明种小鼠2 4只分为3 组，正常对照组及C C l 4 模型对照组予以相应体积的生理盐水，C O S 组灌胃给予C O S （1.5 g/kg ），后2组于第1 2 天腹腔注射C C l 4（20 mg/kg ）形成肝损伤模型。测定3 组小鼠血清中丙氨酸转氨酶（A L T ）和天冬氨酸转氨酶（A S T ）活性，以及肝匀浆中丙二醛（M D A ）含量和D N A 损伤情况。结果C O S 组与C C l 4 模型对照组相比，A L T，A S T 活性和M D A 含量分别低6 2 . 2 ％，5 2 . 9％和3 4 . 3 ％。D N A 电泳结果示，C O S 组与C C l4 模型对照组的D N A 链都形成一系列约1 000 bp 的DNA 片断。
结论COS 对CCl 4 诱导的肝损伤有较明显的保护作用，但是不能减轻DNA 的氧化性损伤。
CCl4在细胞色素P450还原酶系统的还原激活下生成自由基，诱导细胞膜脂质过氧化，脂质过氧化产物对细胞膜的结构和功能造成不可逆转的改变[6]，而脂质过氧化程度可以通过脂质过氧化产物MDA 的含量来间接评价。AST 和ALT 是肝损伤的标志酶，在正常条件下，这些酶存在于细胞质中，当细胞膜受到损伤时就会释放，在体液中流通，故血清中A S T 和A L T 酶活性升高能够反映细胞膜结构的损伤。本实验结果表明，连续12 d 灌胃给予COS 能够抑制CCl4 诱导的肝损伤小鼠血清中AST 和ALT 酶
CCl4在细胞色素P450还原酶系统的还原激活下生成自由基，诱导细胞膜脂质过氧化，脂质过氧化产物对细胞膜的结构和功能造成不可逆转的改变[6]，而脂质过氧化程度可以通过脂质过氧化产物MDA 的含量来间接评价。AST 和ALT 是肝损伤的标志酶，在正常条件下，这些酶存在于细胞质中，当细胞膜受到损伤时就会释放，在体液中流通，故血清中A S T 和A L T 酶活性升高能够反映细胞膜结构的损伤。本实验结果表明，连续12 d 灌胃给予COS 能够抑制CCl4 诱导的肝损伤小鼠血清中AST 和ALT 酶
综述：酒精性肝病
酒精性肝病（ALD）包括一系列临床病症和形态学上的改变。病情由轻到重主要分为脂肪肝，肝脏炎症和坏死（酒精性肝炎），进展性纤维化（酒精性肝硬化）这几个不同阶段。过度饮酒是它的最重要的病因。ALD的发病机制较为复杂，当前研究主要集中在能量代谢异常，脂质过氧化和免疫机制这几方面。目前对于ALD的临床诊断并不困难，但是治疗方法较局限，缺乏有效安全的手段。肾上腺皮质激素治疗和肝脏移植等方法还存在争议，许多新的治疗方法还在研究阶段。
一 流行病学
酒精性肝病(ALD)是一种主要由过量饮用含酒精饮料引起肝脏疾病(1)。在西方国家，80％的肝硬化是由于酒精引起的，而在发展中国家，大部分的肝硬化是血吸虫肝病的结果(2)。然而随着经济的发展，尤其是70年代以来，在美国等国家酒精性肝病的发生率有所减少，但是发展中国家该病的发生率正迅速上升(3)。
虽然有报道称酒精引起的肝脏损害与酒精的摄入量存在剂量依赖关系，但是没有一个确切的能够引起酒精性肝病的摄入量临界值(4-7)。 经过多组统计数据分析，认为成年男性每日摄入酒精超过40－80克,成年女性每人摄入酒精超过20－40克，并且持续饮酒10－12年，通常会发生酒精性肝病(4,8,9)。
分析表明，长期大量饮酒者中大部分会发生酒精性肝病，但是只有10－35%发展成为酒精性肝炎，最终仅8－20％演变为肝硬化(10-13)。事实上，并非所有嗜酒者最终都发生酒精性肝病，疾病的严重程度也不总是与摄入酒精的量成正相关。因而众多学者认为环境因素，遗传因素等在酒精性肝病的发生过程中起到了不容忽视的作用(14,15)。
一旦发生了酒精性肝炎或酒精性肝硬化，持续饮酒将会导致预后不良。临床上，处于酒精性肝硬化代偿期的患者如果坚持戒酒，其五年生存率大约为90％，此时如果持续饮酒，其五年生存率低于70％。对于已经处于失代偿期的患者来说，如果持续饮酒，他们的五年生存率只有30％左右(16-19)。
二 发病机制
酒精性肝病是一种有明确的病因，但是发病机制非常复杂的疾病。迄今为止，有不少对于酒精性肝病的发病机制的研究，其中还存在着许多争议。现在普遍被接受的观点认为，一些主要作用因子及次要作用因子相互作用从而诱发并且促进酒精性肝脏损害。
主要作用因子包括：
遗传背景
1.遗传因素 多组家族，双胞胎以及领养研究显示遗传因素在酒精性疾病的发展过程中发挥了很重要的作用。基因多态性研究揭示，当乙醇脱氢酶（ADH）的编码基因的变异体编码产生低活性的ADH时，将导致乙醛生成障碍，促使乙醇通过非ADH途径代谢，例如CYP2E1及其它非氧化途径。这样会增加对肝脏的毒害作用。同样，当CYP2E1基因变异体编码产生高活性的CYP2E1时，经过这一途径代谢的乙醇大大增加，产生更多的自由基和脂质过氧化反应，也会增加肝毒性损伤(20,21)。而乙醛脱氢酶（ALDH）的基因多态性则主要关系到女性和一些特定人群（例如亚洲人）对乙醇的敏感性(22-24)。
在枯否细胞中编码CD14的基因的多态性现象可以引起这些细胞对内毒素的敏感性增加(25,26)，而之前Tilg和Diehl就在研究中发现内毒素水平和酒精引起的肝脏损害之间存在相关性(27)，因此CD14基因的多态性会增加发展为肝硬化的危险性(28)。
此外，与DNA损伤后进行切补修复有关的酶类容易受到自由基的损害。并且一种XRCC1基因编码的蛋白能够与这些酶类形成复合物，这一基因的多态性则可导致DNA损伤修复功能的下降(29,30)。另外，促炎症因子（例如，TNF-α）和抗炎症因子（例如，IL-10）等的多态性现象也影响到发生酒精性肝病的危险性(31,32)。
2.性别 前瞻性研究表明女性在摄入与男性同等量甚至是一半量的酒精时，她们发生酒精性肝病的风险要高很多。产生性别差异的主要机制有以下几点：
1).药代动力学。由于女性体液容量低于男性，而脂肪比例较高，所以在摄入同等量的酒精后血液中的酒精浓度高于相同情况下的男性(33,34)。
2).胃内的ADH活性。有研究指出女性胃内的ADH活性低于男性。因此使酒精代谢的第一步，即在胃内的分解收到影响(35)。但是考虑到消化道内ADH的活性还和年龄，遗传和胃肠道形态有关，所以这一机制还有待进一步研究。
3).雌激素有关反应。女性雌激素水平较高导致消化道渗透性升高，由此途径进入体内的内毒素增多，激活枯否细胞，引起CD14及TNF-α表达上升(36,37)。
4).骨桥蛋白。在动物实验中发现雌性动物的肝细胞表达骨桥蛋白水平较高，这是一种基质蛋白，会使肝脏发生中性粒细胞浸润，对酒精性肝病的易感性增高(38)。
3.种族差异 在对酒精性肝病的流行率及死亡率的研究中发现，不同种族人群易感性不同。例如在美国，黑人和西班牙人发生酒精性肝硬化的比例要高于白人。当然，这种现象需要综合考虑到除种族以外的其它因素，如不同的饮酒量和酒精饮品的种类还有他们社会经济状况的差异等(39,40)。
肝脏损害机制
1.能量代谢 长期饮酒降低了线粒体复合物的活性，影响线粒体呼吸链。酒精可以使细胞色素氧化酶的含量及活性下降，损伤电子传递和质子转位(41,42)。这样，肝细胞的能量代谢遭到破坏导致了肝脏组织的破坏。同时，能量代谢异常使肝细胞的摄氧率大大增加(43)，尤其是在小叶中央区，这种情况下肝脏为了代偿而增加血流量。但是血流量增加的幅度并不能满足肝细胞的需求，所以导致小叶中央区缺氧。
缺氧会进一步影响肝脏血液动力学改变。主要表现在增加门脉血压的同时引起肝内血管收缩，后者的改变往往更明显(44)。因此当血液中酒精水平较高时，随着灌注减少和耗氧量增加会出现缺氧；随后当血液酒精水平降低时，肝小叶灌注也随之恢复，但是此时会诱发再灌注损伤(45)。
2.氧化应激 氧化应激在酒精性肝病的发展过程中起主要的作用。肝脏中，酒精氧化产生水和二氧化碳主要通过三大肝酶系统：胞质中催化这一反应的是ADH；微粒体乙醇氧化系统中主要的酶是CYP2E1;过氧化氢酶则在过氧化物酶体的膜上起作用。所有以上途径都会产生乙醛这一毒性中间产物。乙醛与其它的反应性残基形成化合物（如，丙二醛）作用于蛋白质和小分子物质，介导脂质过氧化反应和核酸氧化(29)。
乙醇促使肝脏氧化应激增强，产生大量活性氧（ROS）。此外，乙醇的代谢还伴随着NAD的大量消耗，致使NADH/NAD比率改变，而在通常情况下，这一比率是由三羧酸循环进行精密调节的。这一系列的改变是糖类和脂类代谢收到影响，最终破坏糖异生作用，使生酮作用和脂肪酸合成增加(29,46)。NADH，这个重要的还原当量水平迅速升高进一步影响线粒体的电子传递链，使得大量的超氧负离子生成。因此，线粒体成为ROS产生的重要场所，逐步造成细胞损失和坏死。最终，由于NADH诱发，线粒体中β－氧化受到抑制导致细胞内脂质积累，促进了脂肪变性(47)。
过量的酒精摄入同样影响到与CYP2E1有关的酒精代谢途径，这一途径产生ROS，并且使呼吸链中的电子缺失，导致肝脏不可逆的损失，与ALD 的发生有着直接关系(48,49)。
3.免疫机制 酒精摄入可以增加肠道渗透性，使一系列物质易于通过，其中包括细菌内毒素，例如，脂多糖（LPS）。LPS可以与CD14受体结合致敏枯否细胞。这种结合活化NF-kB，进而使TNF-α，IL-6，TGF-β等转录增加(50-52)。 TNF-α，IL-6主要与急性期蛋白合成有关，TGF-β则涉及到活化肝脏星状细胞合成纤维。这些改变诱发炎症反应，凋亡和纤维化，促进肝脏疾病进展，最终进入肝硬化阶段。
现阶段研究发现 ，酒精的代谢产物可以与肝细胞膜蛋白上的活性赖氨酸残基通过共价键结合，表现出免疫原性，从而诱发免疫反应产生抗体或者使T细胞活化(53-55)。在对ALD患者的血液分析中发现，酒精可以引起针对肝细胞的抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(56)。然而，ALD发病的免疫机制远远要比我们知道的要复杂的多，仍然需要进一步研究。
次要作用因子包括：
营养因素 营养不良常常和ALD伴随发生。嗜酒者中营养不良发生率很高，一方面与他们膳食不均衡，主要热量依靠酒精供应有关；另一方面，他们的骨骼及内脏蛋白分解代谢增强，脂质代谢紊乱(57,58)。ALD患者往往同时还有叶酸及B族维生素缺乏症，这些容易导致贫血和夜盲症。另外，蛋白质热量营养不良通常预示ALD患者预后不良(59)。
其它共存肝脏疾病
1.铁贮积 慢性嗜酒者常常存在较高的肝脏铁离子浓度，通常由于ALD患者的肝细胞及枯否细胞摄入铁的能力提高。虽然对于肝脏铁贮积的原因还不清楚，但是已经发现这一现象增加了肝脏的损伤程度和肝硬化的风险(60,61)。
2.丙型肝炎 研究发现70％以上的丙型肝炎病毒（HCV）感染者有过酗酒史，30％的ALD患者感染了HCV(62,63)。酒精摄入加速了慢性丙型肝炎发展到肝硬化(64)。动物实验证明，酒精加强了HCV在mRNA水平和蛋白水平的复制表达(65,66)。
三 病程进展
酒精性肝病（ALD）主要有三种形式：酒精性脂肪肝（脂肪变性），急性酒精性肝炎，酒精性肝硬化(67)。在大量饮酒者中，至少有80％的人发生脂肪变性，10％～35％发展为酒精性肝炎，另外有大约10％的人最终发展为肝硬化(2)。
酒精性脂肪肝（脂肪变性）
统计数据表明持续每天摄入80克酒精，就可以导致酒精性脂肪肝。这个阶段，患者病变肝细胞中可见到单个巨大的甘油三酯滴占据了细胞质的绝大部分空间。但是这一阶段患者的肝功能各项指标往往是正常的。这时如果戒酒，病变是可逆的；但是如果继续摄入大量的酒精则会导致病情继续发展，甚至进入肝硬化阶段(2)。这一阶段中，患者很少直接死于脂肪肝，死亡病例往往是由于疾病所伴发的脂肪栓塞和肝脏衰竭引起的。
急性酒精性肝炎
酒精性肝炎患者的部分肝细胞由于细胞内液持续增加累积而发生膨胀，呈球形。同时，在核周可见一种噬酸性包涵体，其中含有可溶性的角蛋白，称为“马洛里透明小体”(68)。这种现象并不是酒精性肝炎所特有的，在肝豆状核变性（Wilson’s病）和原发性胆汁性肝硬化中都可见到。马洛里小体中浓集着肝细胞的细胞骨架碎片。在这个阶段中，死亡率高达30%～60%,即使停止饮酒，病情仍不能逆转，这种现象可能与肝脏再灌注损伤有关(2)。
酒精性肝硬化
肝硬化是酒精性肝损害中最严重的形式。狂饮比起单纯的持续饮酒来危险性更高。这时，可以见到胶原沉积在肝细胞周围，Disse腔周围或者围绕在中央静脉周围，最后这种情况可导致迅速进展为肝硬化，并且这种情况发生在女性患者中更加危险。胶原进而形成胶原桥，介于中央静脉和肝门束之间，破坏了肝细胞的正常排列，这样就形成了再生结节。发展到这一阶段，患者的一年生存率为60％－70％，五年生存率为35％－50％(2)。
四 诊断
1、长期酗酒史
一个准确的长期酗酒史是评价酒精性肝病最重要的因素。CAGE问卷评分(2)（表1）可以有效的评价是否酗酒，从配偶、家庭成员和朋友了解其酗酒史是非常重要的。
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CAGE 问卷：
C：你是否曾经想停止饮酒？
A：你是否曾经对你饮酒的批评感到懊恼？
G：你是否曾经对饮酒感到内疚？
E：你是否曾经一起床就喝一杯？
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2、临床表现
酒精可导致明显的肝损而没有肝病的任何症状和表现。病人通常有非特异性的表现如：恶心、呕吐、腹部不适以及腹泻。晚期肝病患者可能表现为黄疸、腹水、脑病或上消化道出血。ALD病人可能由于主动来医院要求治疗酒精中毒而诊断。病人通常有酒精引起的其它疾病如肺炎、肋骨骨折或者头部损伤。肝损可能由于酒精对胰腺、心脏、脑和末梢神经的损伤而一同发现。
脂肪肝病人通常看起来很好只有轻度肝肿大。酒精性肝炎患者通常看起来营养不良伴发热。病人有严重的黄疸和慢性肝病患者的皮肤改变。患者有明显的肝肿大，腹部触痛明显。可以听到肝脏杂音。脾肿大少见。腹水和肝性脑部常见但脉管曲张少见。上消化道出血一般不会发生。病人通常有感染。酒精性肝硬化的临床表现和非酒精性的类似。但在酒精性肝硬化患者中蜘蛛痣、腮腺肿大、男性乳房发育和肝肿大更常见。
3、实验室检查
1）γ-谷氨酰基转移酶和平均红细胞容积
这2个是最常用的实验室指标，升高的血清γ-谷氨酰基转移酶和平均红细胞容积提示过量的酒精消耗。单独的指标检测有30％－40％的敏感度，2项联合测试更为可靠。在非酒精性脂肪肝和药物（如苯妥英）导致的肝酶变化患者中，γ-谷氨酰基转移酶可以有一定的升高。严重酗酒者，肝功能正常仅有γ-谷氨酰基转移酶升高提示轻度肝脏损害并且是可逆的。在这种情况下不必要进行肝组织活检来评价肝损伤。
2）缺糖转铁蛋白
血清缺糖转铁蛋白是一个特异性和敏感性的指标来检测酒精中毒，但没有广泛使用，通常上面两个指标很有效。
3）血清转氨酶和高胆红素血症
血清转氨酶水平在ALD病人中通常没有显著的升高。超过正常值5倍的血清转氨酶值需要考虑其它诊断,如病毒或自身免疫性肝病。高胆红素血症在酒精性肝炎中显著升高，是肝炎的敏感反应。
4）凝血酶原时间和白蛋白
凝血酶原时间延长和白蛋白减少提示肝合成功能下降。
5）凝血酶原时间和血清胆红素
基于凝血酶原时间和血清胆红素（mmol/l）的评分可以评价短期内酒精性肝病的死亡率(69)。判别函数（DF），DF＝4.6×（凝血酶原时间－对照时间）＋血清胆红素/17.1。分数>32提示严重的病情有超过50％的死亡率，需要皮质激素治疗。
6）白细胞和血小板
白细胞和血小板升高在酒精性肝炎中很常见。直接的酒精毒性和门脉高压导致的脾亢继发血小板减少。
7）电解质
酒精性肝病中低钠、低钾比较常见，低钙和低镁少见。
8）血清纤维化标志物
一些血清纤维化标志物可以反应酒精性肝损的程度。如原胶原III前肽、层粘连蛋白和IV型胶原。但是在检测单个病例时，这些指标缺乏足够的灵敏度和特异性。
4、影像学检查B超：通过肝实质的变化提示脂肪肝和肝炎。不正常的肝萎缩提示严重的肝硬化。B超可以鉴别肝病的其它证据如腹水、脉管曲张和脾肿大。多普勒可以反映肝动脉和门静脉血流的变化。新的技术如磁共振波谱正在进行临床评价(70)。
5、肝组织活检
肝组织活检可以确定肝脏损伤的程度以及提供预后的指导。但由于酒精性肝炎和肝硬化导致的凝血障碍可能需要通过颈静脉途径进行活检。
6、门脉压力检测
在预测酒精性肝硬化患者死亡率方面，肝静脉造影时检测门脉压力优于Child-Pugh评分并且出血风险小。
五 治疗
1. 戒酒
戒酒是治疗酒精性肝病各项措施中最首要的也是最关键的一项。戒酒需要患者家人和朋友的鼓励与支持。尽管多数患者已经意识到了戒酒的重要性，但仍有不少人会再次酗酒，这时可以考虑给予药物辅助，例如纳曲酮，纳美芬等，阿坎酸（GABA受体激动剂）也能显著减少患者饮酒频率，但是机制尚不清楚(2)。
2.营养支持
由于ALD患者常存在营养不良，所以均衡的膳食非常重要。此外还应考虑到ALD常见的维生素B缺乏症，针对患者症状适当补充维生素B，叶酸等。对于重度营养不良患者需由营养师制定营养配给，并通过鼻胃管、鼻空肠管喂养(2)。
3.糖皮质激素
对于已经处在酒精性肝炎阶段的患者，可以使用糖皮质激素治疗。其主要原理是抑制脂多糖，马洛里小体及肝细胞膜抗原等诱发的免疫反应。同时激素还可抑制炎症反应和细胞因子的合成，因而是现在治疗酒精性肝炎的主要方法。但是激素治疗有很多严重的副反应，所以要对使用该药的患者进行选择，一般用于重症例如肝性脑病等，而且要选择合适的用药法，持续时间和剂量。有消化道出血，急性感染，胰腺炎，肾衰的患者禁用(71)。
4.体外肝脏支持
分子吸附再循环系统（MARS）运用体外白蛋白透析技术，通过透析去除体内积聚的毒素，主要使用于急性肝脏衰竭患者。这一疗法在治疗各种病因引起的严重的肝脏衰竭，控制肝性脑病进展中取得良好的疗效。虽然这种疗法已经成功挽救了许多病人的生命，但是它不能治疗疾病本身，而且由于费用昂贵，目前为止仅作为对于重症患者的抢救措施或者作为暂时支持来帮助病人等待肝脏移植(71)。
5.肝脏移植
对于ALD患者来说，移植可以带来很好的预后。但是由于酗酒者对于酒精有生理和心理上的依赖，移植后再次酗酒会导致疾病再次发生，所以必须在移植前六个月戒酒，通过考查患者的戒酒行为决定其是否适用肝脏移植术。在以往的移植病例中还是有一部分患者术后继续饮酒导致疾病复发，所以现在关于有限的肝脏来源是应该分配给ALD患者还是给其它严重的肝病患者的伦理讨论还在继续(71)。
6.其它新的疗法
目前有一系列新的治疗方法正处于研究阶段，如TNF-α抑制剂,N-乙酰半胱氨酸和其它抗氧化剂，青酶胺，秋水仙素，胰岛素及胰高血糖素，S-腺苷甲硫氨酸，钙通道阻滞剂和血管加压素等。但是这些疗法都存在各方面的副作用，并且处于疗效还不确定(71)。
7.将来的研究方向
随着ALD的发生机制，病理过程的研究的深入，许多科学家认为肝细胞的凋亡是酒精性肝炎的重要病理特征，所以今后对于抗凋亡的研究会对ALD的治疗起关键作用。
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