壳寡糖免疫调节作用的研究进展
李昱1,2，许青松1，彭强1,2，李曙光1，杜昱光1
(1 .中国科学院大连化学物理研究所，辽宁大连116023；2 .中国科学院研究生院，北京100049)
摘要：壳寡糖具有抗肿瘤、抗氧化、抑菌等众多生物活性，具有极大的医用价值。近年来，人们对壳寡糖调节免疫投入越来越多的关注，发现对静息状态的免疫细胞，壳寡糖具有增强免疫的作用；而对炎性免疫细胞，壳寡糖又具有抑制其炎症因子高表达的作用。本文将综述壳寡糖对免疫细胞的调节作用，为免疫调节剂的开发应用提供理论依据。
关键词：壳寡糖；免疫调节；炎症
中图分类号：R285 文献标识码：A
Research advances of Chitosan oligosaccharides on immune adjustment
LI Yu, XU Qing-song, PENG Qiang, LI Shu-guang, DU Yu-guang
(1．Dalian Institute of Chemical Physics，Chinese Academy of Science，Dalian 116023，China；2．Graduate School of Chinese Academy of Science，Beifing 100049，China)
Key words：chitosan oligosaccharides; immune adjustment; inflammation
壳寡糖（chitosan oligosaccharides，COS），是N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）和氨基葡萄糖（GlcN）以β-1,4糖苷键连接而成的同聚物或异聚物。壳寡糖自身氨基带正电荷，是目前仅知的唯一碱性寡糖。几丁质经强碱部分脱乙酰基之后生成壳聚糖。壳聚糖经酸水解和化学合成法，进一步脱乙酰形成壳寡糖，它无毒，有较好的生物相容性和生物可降解性。壳寡糖的生物活性依赖于分子量，聚合度，脱乙酰度，这些指标与壳聚糖和酶解反应所用酶的特异性有关[1]。研究发现，壳寡糖可抑制肿瘤生长，抑制炎症反应，增强骨强度，有抗菌、抗疟疾等作用[2,3]。
免疫系统担负着抵御入侵的病原体、毒性物质和微生物等任务。壳寡糖可对体内免疫应答进行正负双向调节的作用，从而使免疫应答适度，以维持机体内环境的相对稳定。壳寡糖既可激活并增强免疫应答反应，又可使过度激活的免疫应答自限减弱，增强机体抗感染、抗肿瘤等能力。
1 壳寡糖对中性粒细胞的双向调节作用
急性时相反应时，中性粒细胞过度激活，大量细胞因子释放导致组织和器官严重损伤，抑制中性粒细胞过度激活对保护机体免受急性时相反应时的损伤有利。研究发现壳寡糖可增强静息中性粒细胞的活力，却降低豆蔻酰佛波醇乙脂（PMA）诱导的中性粒细胞活性，说明中性粒细胞的过度激活状态能被壳寡糖抑制[4]。体内研究证实，100 µg/ml壳寡糖能激活PLD和PI3K，促使糖原诱导小鼠腹膜炎模型的中性粒细胞产生超氧化物和过氧化氢，引起细胞凋亡[5]。
2 壳寡糖对巨噬细胞的双向调节作用
2.1 壳寡糖激活静息状态的巨噬细胞
壳寡糖能增强小鼠腹腔巨噬细胞的迁移活性和吞噬能力[6]。40 μg/ml壳寡糖作用24 h，能显著提高小鼠巨噬细胞RAW264.7的IL-18表达水平[7]。当壳寡糖单独作用于RAW264.7细胞，可促进IL-1β的表达，呈浓度和时间依赖性，在40 mg/mL，18 h 时接近饱和，而细胞经IFN-γ预刺激后，壳寡糖促进细胞表达IL-1β的能力增强[8]。体内试验结果表明，按125，250，500 mg/kg的剂量给昆明小鼠连续灌胃20天，不仅可提高小鼠非特异免疫功能（表现为脾、胸腺指数升高，单核细胞吞噬能力增强）；还可提高小鼠特异性免疫功能（表现为半数溶血值升高，足跖肿涨程度更明显）[9]。
2.2 壳寡糖抑制刺激物对巨噬细胞的激活
脂多糖（LPS）刺激RAW264.7细胞，使其高表达NO和TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β等细胞因子，而细胞经壳寡糖预处理后，LPS的这种作用被下调。壳寡糖可能通过以下机制抑制LPS激活的细胞释放NO和细胞因子：上调精氨酸酶表达；抑制NF-κB激活以及由此产生的TNF-α[10-12]。此外，壳寡糖还可通过阻断COX-2蛋白的表达从而抑制PGE2的表达[12]。壳寡糖的这些作用依赖于它的分子量、作用浓度和作用时间。
另有研究表明，壳寡糖显著抑制LPS与TLR4/MD2受体复合物结合，减弱MAPKs活性，降低NF-κB的核转运,降低LPS-刺激的RAW264.7细胞中促炎介质，如IL-1β和NO的产生，因此壳寡糖是LPS的潜在抑制因子[13]。
2.3 壳寡糖与细胞表面相关蛋白的结合方式
壳寡糖可联合IFN-γ，通过结合RAW264.7细胞表面的CD14受体、Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)、和甘露糖受体(mannose receptor，MR)，协同诱导NF-κB活性和NO产生，激活巨噬细胞[6,8]。而Feng等[14]的研究认为，壳寡糖刺激巨噬细胞表达TNF-α和IL-1β，发挥此作用的先决条件是壳寡糖与巨噬细胞表面特异性受体结合，甘露糖（甘露糖受体配体）能抑制巨噬细胞对壳寡糖的内化，而脂多糖（CD14配体），β-葡聚糖（CR3配体）均无此作用；其它甘露糖受体：甘露糖-BSA，岩藻糖-BSA，GlcNAc-BSA均能抑制壳寡糖的内化。因此认为壳寡糖在巨噬细胞膜上的受体是甘露糖受体。GlcNAc单体抑制巨噬细胞对壳寡糖摄取，而GlcN无此作用，说明壳寡糖的GlcNAc单体在被巨噬细胞甘露糖受体识别中发挥重要作用。
Ym1是在旋毛虫感染小鼠过程中，由被活化的腹腔渗出细胞暂时产生的分泌性蛋白质，是一个分子量为43kDa的单链多肽。分子选殖发现，Ym1和几丁质酵素具有很高的序列相似性，对于具有自由胺基的糖类，如葡萄糖胺，半乳糖胺，葡萄糖胺多体有结合特异性。经由寄生虫感染或是脑部受伤害引起发炎而活化的巨噬细胞，暂时性高表达Ym1[15,16]。这一研究成果提示我们，Ym1蛋白作为“动物型糖结合蛋白”是否在壳寡糖发挥抗炎作用过程中起重要的中介作用呢？
3 壳寡糖对树突细胞的调节作用
最新研究发现，壳寡糖能激活树突细胞，使CD4+T细胞增殖显著。Dang[17]的研究表明，壳寡糖（聚合度7-16）可通过小鼠树突细胞上的TLR4上调细胞MHCⅡ和CD86的表达，进而促进TNF-α表达量升高。
4 壳寡糖对内皮细胞的调节作用
当内皮细胞由促炎因子激活，如TNF-α和IL-1β，可快速表达E-selectin，识别粒白细胞上的糖链，导致粒白细胞滚动粘附于内皮细胞。Lin等[18]的研究发现，200 µg/ml的N-乙酰化壳寡糖（NACOS）预处理24h能显著抑制TNF-α（100 U/ml，4 h）诱导人脐静脉内皮细胞（HUVECs）产生E-selectin。NACOS预处理内皮细胞，能抑制TNF-α诱导的JNK活性，说明JNK参与NACOS对TNF-α诱导E-selectin表达的抑制作用。
50-200 µg/ml 壳寡糖 预处理24 h，显著抑制LPS（100 ng/ml，6 h）诱导的HUVECs细胞IL-6表达水平的增加。这种作用可经至少2条平行信号通路调节：一条通过不依赖于NF-κB的p38 MAPK通路，另一条通过依赖于NF-κB的ERK1/2通路。壳寡糖能抑制LPS使NF-κB从胞浆转移到胞核定位的作用[19]。此外，壳寡糖还可通过阻断TNF-α诱导的NF-κB活性，p38和ERK1/2磷酸化，在转录和翻译水平抑制TNF-α诱导的VCAM-1和ICAM-1的表达；通过部分阻断p38和ERK1/2信号通路，降低U937单核细胞粘附到HUVECs[20]。
5 壳寡糖作为免疫调节剂的应用
壳寡糖具有良好的水溶性和生物相容性，几乎没有免疫原性，具有多种特殊的生物活性，已成功产业化并实际应用于各领域。
在保健品领域，以壳寡糖为主要原料的保健品可激活巨噬细胞、NK细胞以及补体，刺激机体淋巴细胞增殖，增强机体免疫力[21]；促进肠道益生菌双歧杆菌的增生并抑制有害菌生成，调节肠道菌群[22]。
在饲料添加剂领域，壳寡糖具有较大的应用前景，其在养殖业中的应用见于生猪、肉仔鸡、鹌鹑等，可显著提高动物免疫力，促生长，提高肉料比，改善动物肠道形态以利于养分吸收。研究表明，以3 mg/kg的壳寡糖喂养断奶长白猪2-5周，可显著增加其血中淋巴细胞数，降低粪便中大肠杆菌数[23]。向饲料中添加125 g/t的壳寡糖可使肉仔鸡平均体重增加140 g，提高5.85%，料重比降低3.93%，空肠和回肠绒毛高度和隐窝深均增加（P<0.05）[24]。壳寡糖作为抗生素替代品应用于饲料养殖方面的研究表明，壳寡糖添加于肉鸡饲料，具有与金霉素相似的促生长作用并提高免疫功能，其适宜添加量为100 mg/kg[25]。
6 展望
壳寡糖目前主要作为食品添加剂应用于保健品行业，其次作为饲料添加剂应用于养殖行业，另外还有一些壳寡糖开发成具有特殊治疗用途的药品。壳寡糖具有调节机体正常的免疫功能的活性，不但能激活静息状态的免疫细胞，还有保护炎症细胞过度激活的作用，这为壳寡糖产业化应用于医疗保健、饲料加工等领域提供了理论依据。
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